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Small RNA测序




Small RNA是一类重要的体内调节分子,长度在18-30 nt之间,主要包括miRNA、piRNA和siRNA。它的功能主要是诱导基因沉默,参与基因转录后调控,从而调节细胞生长、分化,以及个体发育、生殖等重要生物学过程。登陆量测序技术可以对样本中所有Small RNA家族进行测序和表达定量,从而娱乐miRNA、siRNA、piRNA和其它非编码RNA以及相应靶序列。



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Small RNA测序与转录组实验设计思路比较类似,为差异比较,还可以对其靶基因进行预测,在进行取样时, 每一组样品建议设置至少3个生物学重复。

在常规信息分析之外,派森诺生物提供多种高级分析项目。


技术线路

全国际甲基化测序技术路线.jpg

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高级分析内容

要 求

样品间共有序列及特有序列分析

作图样本数不超过5个

差异miRNA维恩图

作图样本数不超过5个

miRNA与mRNA互作分析

提供mRNA数据

miRNA前体与转录因子结合网络分析

只定关注转录因子及miRNA

miRNA碱基编辑分析





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差异 microRNA 前体与转录因子结合网络:利用 microRNA 与转录因子序列的结合匹配,得到能对microRNA 前体的转录进行调控的转录因子,基于转录因子与 microRNA 的调控关系,构建得到转录因子对microRNA 的调控网络。


Small RNA测序结果1.png


*miRNA- 转录因子调控网络, 方块代表转录因子, 圆圈代表miRNA



差异 microRNA 靶基因 GO 和 pathway 富集及网络分析:

找出差异 miRNA 的靶基因,应用 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)对这些基因进行 GO 注释和 KO 注释,并进行网络分析。


Small RNA测序结果2.png

经典案例:
 

1、mRNA-miRNA测序揭示南极冰鱼红细胞缺失分子进化机制

Evolutionary suppression of erythropoiesis via the modulation of TGF-β signalling in an Antarctic icefish

研究背景

南极冰鱼是生活在南极海域的南极鱼类的一种,可以适应超低温的生活环境。冰鱼体内含有丰富的鱼脂肪DHA、EPA,加上钙质含量丰富,具有较高的营养价值。与众多红血南极鱼类相比,南极冰鱼是唯一同时缺乏红细胞和血红蛋白的南极鱼。该物种对于人类贫血症、血细胞生成失调等疾病的研究具有很高的参考意义和学术价值。

研究目的

以南极冰鱼(Chionodraco hamatus) 和两种红血南极鱼(Gymnodraco acuticeps, Trematomus bernacchii)为研究对象,应用Illumina HiSeq测序平台进行转录组和miRNA测序,采用多种分析方法和实验验证,揭示了南极冰鱼造血特殊性的相关机制及其与低温环境适应性的相关性。

研究结果

1. 南极冰鱼与两个红血南极鱼之间造血相关基因表现出差异表达

图1 南极冰鱼与两种红血南极鱼之间造血相关基因的表达量比较

2.南极冰鱼中与红血球生成调控相关的miRNA显著上调

图2 A) miRNA测序结果的qPCR验证 B)上调的miRNA对5个造血标记靶基因的调节

3.实验验证上调的miRNA参与红血球生成抑制

图3 体外显微注射和免疫印迹结果

4. TGF-β信号通路相关因子的进化分析表明了冰鱼血红细胞的丢失对低温环境适应的进化意义。

Xu Q, et al. (2015) Evolutionary suppression of erythropoiesis via the modulation of TGF-beta signalling in an Antarctic icefish. Molecular ecology 24(18):4664-4678.

 
 

2、胶质瘤样本的mRNA-miRNA联合分析

Transcriptome and Small RNA Deep Sequencing Reveals Deregulation of miRNA Biogenesis in Human Glioma

研究背景

哺乳动物 miRNA在细胞分化、凋亡、肿瘤发生过程中发挥重要作用。许多miRNAs是癌miRNAs或肿瘤抑制因子,miRNA表达的变化与肿瘤发生相关,但机制有待研究。

研究目的

通过对不同患病阶段的生物学样本,进行mRNA和small RNA测序,揭示胶质瘤中miRNA生物合成异常。

研究结果

通过small RNA测序,筛选出不同样本中表达丰度高的miRNA 和前体miRNA,鉴定哪些miRNA生物合成基因为预后标记,鉴定出胶质瘤样本中miRNA的表达差异,揭示胶质瘤中miRNA生物合成异常。

图1 胶质瘤中成熟miRNA和前体miRNA表达量分析

图2 miRNA靶标基因网络分析

Moore L. et al., (2013). Transcriptome and small RNA deep sequencing reveals deregulation of miRNA biogenesis in human glioma. J Pathol 229, 449-459.

 

常见问题:
 
  • 登陆量测序研究Small RNA的优势?

    Small RNA登陆量测序主要优势有:(1) 可以直接从核苷酸水平上研究Small RNA分子,不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题,非常利于区分相同家族以及序列极为相似的不同Small RNA分子;(2) 可以对任意物种进行登陆量分析,无需任何预先的序列信息以及二级结构信息;(3) 灵敏度高,测序通量大,为Small RNA分子的发现和研究提供了极大的数据深度与覆盖率,能够检测丰度极低的稀有转录;(4) 测序产生的原始数据可以与多种分析软件兼容,可以注释Small RNA的国际信息,并分析其表达水平,能够随时使用Small RNA数据库注释已知的Small RNA,还可以进一步分析未匹配的数据,发现新的Small RNA种类及异构体,寻找更深入的研究信息。

  • Small RNA测序用到哪些娱乐?

    1) RNA提取:Trizol Reagent;

    2)文库构建:Illumina TruSeq™ Small RNA Sample Prep Kit;

    3)上机测序:Illumina NextSeq™ 500 High Output Kit v2。

  • 什么是小RNA测序?

    Small RNA测序,研究某一物种特定组织在特定状态下的所有已知SmallRNA,也可发现新的或该物种特有的Small RNA并预测其靶基因,为研究Small RNA的功能及此物种的基因调控机制提供了有力工具。Small RNA主要包括微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、与piwi相互作用的RNA(piRNA)三类。


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